ПЦР — экспериментальный метод ранней диагностики гепатита C

Вирус гепатита C (ВГC) — основная причина хронического заболевания печени. По неофициальным данным ВОЗ, число инфицированных людей во всем мире может превышать 200 миллионов человек. Более 50 % диагностированных случаев протекают бессимптомно, выявляются случайно при обращении в клинику с жалобами на другие заболевания. Хотя именно на ранних стадиях гепатита C может быть проведено успешное лечение, которое полностью купирует негативный процесс. В последние два десятилетия медицина существенно продвинулась вперед в плане эффективной терапии благодаря обширным клиническим исследованиям механизма развития ВГC, методов профилактики, диагностических мероприятий.

Опасность вируса HCV (гепатита C) заключается в его способности длительное время маскировать свою суть под множество других заболеваний. Еще 30 лет назад это существенно затрудняло диагностику, патология незаметно становилась хронической формы. Современная медицина позволяет выявлять болезнь на самых ранних стадиях, практически сразу после возможного инфицирования. Первым шагом стало обнаружение в крови больных вирусной РНК. Дальнейшие исследования доказали, что возбудителем гепатита C является РНК-содержащий вирус, относящийся к виду Flaviviridae. Диагностический метод полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет выявить вирусную РНК, определить антитела к болезни в крови. Анализ целесообразно проводить всем пациентам с подозрением на заболевание печени, включая патологии невыясненной этиологии.

Диагностика методом ПЦР

Принцип исследования основан на обнаружении вирусных фрагментов РНК, их избирательного синтеза, дальнейшего распространения. Для анализа характерна высокая степень достоверности, специфичность, чувствительность, скорость проведения. Биологический материал исследуется лабораторными методами на предмет количества и качества молекул РНК, а также для определения генотипа флавивируса HCV. Тест позволяет обнаружить даже минимальное количество инфекционных молекул, еще до образования антител к гепатиту. От этого факта во многом зависит успешность терапии и положительный для жизни пациента прогноз.

Генетическое тестирование полимеразной цепной реакции состоит из нескольких этапов:

• Денатурация — разрушение водородных связей между двумя цепочками ДНК путем нагревания реакционной смеси до 94—96 °C.
• Отжиг — в реакцию вводится праймер (синтетический короткий фрагмент ДНК длиной 20—30 оснований), ограничивающий выделяемый участок.
• Элонгация — к каждой цепочке ДНК достраиваются праймеры, которые определяют специфичность реакции и величину копируемого фрагмента.

В процессе тестирования происходит многократная репликация определенного участка ДНК в искусственных лабораторных условиях (in vitro). Сам принцип методики основан на уникальном свойстве ПЦР. Клонируется только та часть ДНК, в которой есть вирусные молекулы. Биоматериал здорового пациента делает невозможной реакцию. Редко возникает ситуация, когда генодиагностика выдает ложноположительный результат. В этом случае назначается повторный тест.

Типы генетического исследования

Для увеличения специфичности, чувствительности ПЦР-диагностики вируса гепатита C, уменьшения числа побочных продуктов реакции существует порядка 10 видов исследования. Для диагностики заболеваний печени чаще всего используются:

• ПЦР вложенная (nested-PCR) — последовательно проводятся реакции с двумя парами праймеров. Вторая пара копирует участок ДНК внутри первой реакции.
• ПЦР обратной транскрипции (Reverse Transcription, RT-PCR). Проводят на продукте м-РНК синтез одноцепочечной молекулы, получают к-ДНК, которую используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции.
• ПЦР реального времени (Real-Time PCR). Позволяет в автоматическом режиме мониторить, осуществлять количественный/качественный анализ, регистрировать продукты цепной реакции в реальном времени с использованием помеченных реагентов или при помощи миниатюрной видеокамеры. Она передает информацию с гель-электрофореграммы на монитор компьютера. Определяется концентрация исследуемого образца в сравнении с положительным контролем.
• ПЦР-гибридизация in situ. Используется для выявления минимальных количеств вирусных РНК, дает объективное представление о числе зараженных клеток, что крайне важно для выявления латентных, маловыраженных инфильтративных инфекций. Матрицей служит вирусная нуклеиновая кислота, количество которой многократно увеличивается, тем самым повышая чувствительность метода по сравнению с другими видами исследования.

Нельзя переоценить важность полимеразной цепной реакции при диагностировании «тайной» инфекции, когда отсутствуют сывороточные, вирусологические маркеры гепатита C в крови. Например, при циррозе печени неизвестной этиологии данный метод позволяет безошибочно идентифицировать геном HVC или других инфекций, прямых возбудителей заболевания. Генетическая диагностика ВГC проводится одним из способов — генотипирование, секвенирование, качественное/количественное исследование Real-Time PCR. Выбор способа лабораторного анализа осуществляется на основе клинической картины болезни, результатов предыдущих исследований, предварительных врачебных заключений.

Обнаружение гепатита C методом качественного ПЦР-анализа

Принцип исследования во многом схож с классической полимеразной цепной реакцией. Биоматериал подвергается всем стадиям анализа — денатурации, отжигу, элонгации. В случае наличия вирусной РНК происходит реакция. Главная особенность качественного анализа — способность выявлять даже отдельный ген. Но при этом исследование проводится с высокой степенью чувствительности реагентов — не ниже 50 МЕ/мл (МЕ — международная единица измерения концентрации РНК вируса гепатита C в крови).

Существует вероятность получения ошибочного результата теста. Например, при низкой чувствительности выбранного вида исследования или в первые дни после контакта с инфицированным человеком. Если подозрения на заражение не сняты, назначается дополнительный анализ со строгим соблюдением требований:

• стерильный забор биологического материала;
• чистота лабораторных инструментов;
• исключение приема больным противовирусных, других препаратов, влияющих на структуру РНК и состав крови.

Со стороны больного потребуется некоторое время соблюдать диету, прекратить прием медикаментов, отказаться от курения. Если повторный анализ показал отсутствие возбудителя, исследование завершается. При обнаружении патогенных маркеров назначается количественный ПЦР-анализ.

Количественный метод выявления маркеров гепатита C

Тест проводится для определения количества инфекционных молекул в фиксированном объеме биоматериала для дальнейшего подсчета патологической нагрузки на организм в целом. Исследование устанавливает уровень эпидемиологической опасности больного, стадию прогресса гепатита C, вид и длительность противовирусной терапии. Во время лечения анализ назначается для определения эффективности терапевтических мероприятий и чувствительности возбудителей к назначенным медикаментам. Повторять процедуру рекомендуется на 2-й, 4-й, 8-й, 12-й и 24-й неделе медикаментозной терапии. Это помогает скорректировать, увеличить или снизить дозировку препаратов, проанализировать качество лечения, в случае необходимости изолировать больного.

Расшифровкой результатов количественного теста занимается лечащий врач-гепатолог. Пациенту можно ориентироваться на следующие данные:

• показатель от 800 000 МЕ/мл указывает на высокий уровень инфекционной нагрузки и требует немедленной госпитализации больного;
• 400 000 МЕ/мл и ниже — со времени заражения произошло не более двух недель, есть возможность купировать патологический прогресс.

На основании исследования врач-гепатолог составляет клиническую картину заболевания, прогноз для жизни пациента. Высокая достоверность теста позволяет выявить гепатит C на доклинической стадии, что существенно влияет на эффективность лечения и качество жизни больного.

Забор биологических материалов у пациента производится с соблюдением стандартных рекомендаций. Анализ сдается утром, натощак, за 12 часов до теста не употреблять алкоголь, не курить, прекратить прием противовирусных и других препаратов, влияющих на структуру РНК.

Генотипирование

Генотип вируса гепатита C — однородная группа организмов, строго определенной геномной последовательности. Внутри каждого типа бактериальных возбудителей выделяют генотипы, которые имеют одинаковые биологические свойства, репликационную активность, устойчивость к антителам, но различаются по своей структуре, различие может составлять до 15 % нуклеотидных соединений. Эти различия определяют особенности разных генотипов вируса, географические ареалы распространения, способность к сложным мутациям, репликационную активность, характер течения хронического гепатита C, скорость формирования цирроза печени и перерождения в злокачественное новообразование — карциному.

Генотип HCV имеет 11 разновидностей, самыми распространенными являются 1a, 1b, 2a, 3a, 4. В зависимости от этиологии заболевания тип генома определяется одним из методов полимеразной цепной реакции. В случае когда выбранный вид исследования не определяет генотип вируса, назначается более специфичный анализ ПЦР.

Секвенирование вирусного генома

Способ основан на определении нуклеотидной последовательности ДНК и РНК. Позволяет проанализировать сегмент длиной 100—500 нуклеотидных пар, образующихся при расщеплении кислоты. До начала секвенирования проводится обычная ПЦР для выявления участка ДНК/РНК, последовательность которого необходимо определить. Анализ назначается для выявления мутирующих вирусов, которые могут менять биологические свойства инфекции и характер течения хронического гепатита. В ходе лабораторного исследования информация обрабатывается в три этапа:

1. Общие сведения о вирусе — размер генома, ДНК или РНК, фрагментация, распространенность, статус инфекции, связь с ближайшими видами, принадлежность к антигенной группе и т. д.
2. Анализ полученных данных — отнесение вируса к вирусной группе на основании иммунологического типирования, электронной микроскопии или по нуклеотидной последовательности генома
3. Анамнез по доступным для исследователя нуклеотидным последовательностям генома вируса гепатита C, полученные данные становятся основой подбора праймеров для проведения ПЦР.

Множество штаммов, тысячи последовательностей или, наоборот, отсутствие в информационной базе данных о генотипе вируса усложняют работу исследователя. Поэтому важна высокая квалификация научного медицинского сотрудника. От правильной идентификации результатов напрямую зависит жизнь пациента и здоровье его ближайшего окружения.

Расшифровка результатов диагностического ПЦР-анализа

Полученные результаты полимеразной цепной реакции ВГC становятся основанием для постановки окончательного диагноза или назначения дополнительных исследований. Поэтому правильная идентификация показателей становится залогом успешного лечения, качества жизни пациента и предупреждения эпидемиологического риска в среде обитания предполагаемого больного. Возможно получение только двух ответов — положительный результат ПЦР и отрицательный. Приоритетная задача врача — исключить ошибочную интерпретацию, в случае необходимости принять меры для выявления вируса, например, провести повторный тест, более чувствительный или специфичный.

На точность результатов влияет технология проведения лабораторных мероприятий, соблюдение правил и медицинских рекомендаций. Серьезность и опасность заболевания не терпит ошибочных выводов — на кону стоят человеческие жизни.

Преимущества диагностики ВГC методом ПЦР

Определение вируса гепатита C при помощи генодиагностики методом ПЦР является самым точным, надежным и достоверным способом выявить вирус на ранних стадиях формирования. Достоинства исследования очевидны:

• Прямое определение ДНК/РНК-возбудителя инфекции.
• Чувствительность позволяет определять до 10 копий ДНК.
• Специфичность (достоверность) — 99—100 %.
• Для анализа используется любой биологический материал. Это может быть кровь, сыворотка, моча, мокрота, плевральная, асцитическая жидкость, соскобы эпителиальных клеток, а также гистологические препараты, включая фиксированные в формалине.
• Скорость обработки результата — 1—2 суток при проведении обычного ПЦР-анализа, а при выполнении real-time PCR — 1—2 часа;
• Доступная и постоянно снижающаяся стоимость исследования.
• ПЦР выявляет невоспроизводимый вирус, что позволяет обнаружить латентную, слабо выраженную инфекцию.

Тест помогает своевременно обнаружить вирус-возбудитель. Присутствие даже одной молекулы штамма гепатита C в РНК позволяет точно установить причину, назначить соответствующее лечение и контролировать интенсивность терапии.